顯微成像技術現在發展的越來越成熟，這些先進的技術可以幫助我們(men) 在不同樣本類型和圖像應用中捕獲到盡可能多的細節，提供了強大的助力，然而，隨著研究越來越複雜，顯微數字圖像檢測係統越來越多樣，我們(men) 需要對各種顯微相機的運作方式有基本了解，以便適配並采納最佳解決(jue) 方案以滿足成像需求。

因此，了解來自樣本的模擬信息是如何被處理成數字圖像以供存儲(chu) 和展示這一過程的基本概念對於(yu) 顯微鏡操作者來說較為(wei) 重要。無論是比較要購買(mai) 的相機，還是確定實驗室或核心設施中哪個(ge) 現有的顯微鏡最適合研究需求，都必須理解一些基本要素，選配合適的成像係統，來盡可能的獲取高質量數據。

圖像捕獲方法：

光學顯微鏡的數字成像起點，是感知來自樣本不同區域的光子數量（信號強度）並準確識別光子在樣本中的起始位置，其感知到的到達相機傳(chuan) 感器的信號是模擬格式，而相機必須將該模擬信號轉換為(wei) 盡可能準確表示模擬信息的數字信號。

對於(yu) 數字成像，有兩(liang) 種方法獲取模擬信號強度和位置信息。

第一種是幀圖像捕獲，其中來自目標視場的光線同時投影到傳(chuan) 感器陣列上，陣列中每個(ge) 傳(chuan) 感器捕獲來自樣本的一小部分信息，這些信息的陣列組合就形成了我們(men) 觀測視場的中的圖像

這種方式下，相機同時捕獲了光子信號的強度及其在樣本中的位置。（圖1）

圖1

另一種方法是點掃描圖像捕獲——將光聚焦到樣本的一個(ge) 小區域並捕獲來自該小區域的信號（圖2）。

在這種方法中，光束通常在樣本上進行光柵掃描以順序獲取所需的視場。在這裏，傳(chuan) 感器隻捕獲了傳(chuan) 入信號的強度，而其位置信息是從(cong) 照明光束在樣本上的位置推斷出來的。

圖2

全幀圖像捕獲：

幀圖像捕獲係統的案例有不同類型的電荷耦合器件（CCD）和科學互補金屬氧化物半導體(ti) （sCMOS）相機。

不管是CCD還是sCMOS相機，來自樣本的入射光子擊中光傳(chuan) 感器，其能量被轉換為(wei) 電子（圖2）。

其產(chan) 生的電子數量與(yu) 捕獲的光子信號強度成正比。然後電子被轉換為(wei) 電壓，由模擬數字轉換器（ADC）讀取並數字化為(wei) 代表傳(chuan) 入信號強度的灰度值。

然而，在超過一定的光子通量（每單位時間的光子強度）後，傳(chuan) 感器將無法產(chan) 生額外的電子。

這個(ge) 值，就是傳(chuan) 感器的滿阱容量，超過這個(ge) 水平，傳(chuan) 感器就被認為(wei) 是飽和的。

為(wei) 了準確測量信號強度，信號必須保持在滿阱容量以下，最理想情況下是將其控製在最小可檢測信號和滿阱容量之間。

在這種類型的圖像捕獲中，單個(ge) 傳(chuan) 感器的大小決(jue) 定了圖像中的像素大小（分辨率），傳(chuan) 感器大小必須足夠小，才能捕獲由顯微鏡形成的圖像中最精細的細節。

冷卻CCD是使用傳(chuan) 感器陣列設計的兩(liang) 種技術中較老的一種。在最簡易的CCD陣列實現中，落在每個(ge) 傳(chuan) 感器（像素）上的光被轉換為(wei) 電子。在曝光結束時，存儲(chu) 在傳(chuan) 感器中的電子信號被順序地逐行轉移到讀出寄存器，然後逐幀放大並轉換為(wei) 數字值（圖3）。

圖3

這個(ge) 過程需要時間，從(cong) 而會(hui) 減緩相機的幀率。

目前已經開發了幾種CCD處理的變體(ti) 以增加靈敏度。行間冷卻CCD（圖4）是顯微鏡中使用最普遍的CCD類型。

圖4

#在傳(chuan) 統的冷卻CCD相機中，由獨立的傳(chuan) 感器收集的電子被順序地一行一行地傳(chuan) 輸到串行讀出寄存器中。從(cong) 讀出寄存器，電荷被逐像素讀取，放大，並數字化為(wei) 二進製灰度值存儲(chu) 在計算機存儲(chu) 器中並隨後顯示。在行間CCD中，電荷首先從(cong) 單個(ge) 傳(chuan) 感器轉移到存儲(chu) 寄存器中，然後從(cong) 那裏逐行讀出。這使得傳(chuan) 感器可以更快地開始收集另一個(ge) 圖像。

對於(yu) CCD，像素電荷會(hui) 被轉移到存儲(chu) 寄存器中進行讀取，而不是在開始新的曝光之前逐個(ge) 像素地讀出其值，這樣做釋放了單個(ge) 傳(chuan) 感器可以去進行新的曝光。雖然這允許更快的周轉，但電荷存儲(chu) 區域減少了芯片上可用於(yu) 光收集的區域。目前大多數行間CCD使用微透鏡將入射光聚焦到傳(chuan) 感器區域，這在一定程度上緩解了阻擋光的問題。

盡管CCD在顯微鏡中仍有其用途，但在大多數應用場景下，CCD已被sCMOS係統取代。在CCD陣列中，每個(ge) 像素的信息通過一個(ge) 輸出節點、放大器和數字轉換器傳(chuan) 輸，而對於(yu) sCMOS相機，像素是並行讀取的（圖5）。

圖5

他的每個(ge) 傳(chuan) 感器都包含自己的電容器和放大器，每行像素都有自己的ADC。這以更低需求的功率實現了更快、更高效的讀取。

當前sCMOS技術比CCD有許多優(you) 勢，包括更寬的視場、更高的量子效率（QE）、更寬的動態範圍、更快的幀率和更好的功率效率。

另外，CCD和sCMOS的量子效率在所有波長上都不是均勻的。了解相機的光譜響應對於(yu) 數據解釋至關(guan) 重要，特別是在熒光數據中，必須分離來自密切相關(guan) 的光的波長的信號。

盡管sCMOS相機相較於(yu) CCD有一些優(you) 勢，但並不能在所有場景下完全取代。

冷卻CCD比等效的sCMOS係統具有更少的暗電流噪聲，這種噪聲會(hui) 在長時間曝光下累積，因此對於(yu) 需要長時間曝光的、信號非常低的樣本，冷卻CCD將具有更好的信噪比閾值。這些類型的樣本包括生物發光研究、熒光素酶報告成像和基於(yu) 化學還原的熒光。

像素大小影響傳(chuan) 感器的滿阱容量和相關(guan) 的動態範圍。傳(chuan) 感器的動態範圍計算方式是總滿阱容量除以噪聲水平。因此一個(ge) 滿阱容量為(wei) 6000、噪聲水平為(wei) 2e-的傳(chuan) 感器,將具有3000:1的動態範圍.從(cong) 黑到白，它可以區分3000個(ge) 單獨的光子通量水平，並將它們(men) 轉換為(wei) 圖像中的3000個(ge) 不同的灰度值；一個(ge) 滿阱容量為(wei) 34000、噪聲水平為(wei) 2e-的傳(chuan) 感器將具有17000:1的動態範圍，這個(ge) 相機相對具有更強大的能力，能夠清晰識別來自樣本不同區域的信號強度的更微妙的差異，使圖像具有更高的對比度分辨率。

點掃描圖像捕獲：

在點掃描圖像捕獲中，樣本被聚焦光束探測，記錄光束與(yu) 樣本相互作用的信息。激光掃描熒光共聚焦顯微鏡是光顯微鏡中使用的主要點掃描係統。還有其他掃描熒光技術，但這些技術並不廣泛采用。

動態範圍和模擬數字轉換：

動態範圍是一個(ge) 經常被忽視的選擇相機的重要參數——相機係統還必須將原始動態範圍轉換為(wei) 數字值，因此，必須了解相機的ADC能力。

大多數現代相機允許在數據收集期間選擇圖像的位深度，這是一個(ge) 非常有用的特性。例如，12位圖像可以顯示從(cong) 黑色到白色的全灰度作為(wei) 4,096（212）個(ge) 不同的灰度色調，而16位圖像可以存儲(chu) 和顯示65,536（216）不同的灰度色調。

然而，16位圖像相對文件大小更大，而且讀取速度更慢，如果需要高速成像，應選擇較低的位深度。相反，如果目標是最大化對比度分辨率，特別是對於(yu) 定量分析，應使用更高的位深度。

除了位深度，還必須考慮相機傳(chuan) 感器能力。如果相機的動態範圍僅(jin) 為(wei) 4000:1，那麽(me) 在超過12位（4,096灰度值）的對象進行數字化純粹是浪費時間和計算機內(nei) 存的。

熒光顯微鏡的相機要求：

熒光通常比明場的信號更弱，並且由於(yu) 光毒性和光漂白，它並不適合長曝光時間。因此，選擇一個(ge) 具有高靈敏度和低噪聲的相機進行熒光顯微鏡檢查是很重要的。

具有低讀取噪聲和低暗電流噪聲的相機是熒光顯微鏡的理想選擇。由於(yu) 每次捕獲圖像時都會(hui) 發生讀取噪聲，讀取噪聲越低，可以在不降低圖像質量的情況下使用的增益就越高。這允許更短的曝光時間，這有助於(yu) 限製暗電流噪聲。暗電流噪聲與(yu) 溫度和時間有關(guan) ，通常以給定溫度下的每秒電子數表示。在弱信號的情況下，即使是最好的相機，動態範圍也會(hui) 縮小。因此確定在典型數據采集條件下產(chan) 生的動態範圍，將有助於(yu) 確定在哪個(ge) 位水平下執行模數轉換。

幸運的是，熒光圖像通常固有地具有較小的動態範圍，較低的動態範圍通常不會(hui) 對圖像產(chan) 生不利影響。

事實上，盡管了解了顯微相機的運作模式和評估的關(guan) 鍵參數，讓我們(men) 直接比較相機的數據並得出確切的結論並非易事，因此仍然推薦查看相機的參數後，在實際條件下去進行相機試用測試，來確保能夠得出最佳的效果。

【文章來自MicroscopyEducation

Choosing the Best Camera System for Your Biological Light Microscopy Needs: Part II  W. Gray (Jay) Jerome

Pathology, Microbiology and Immunology, Vanderbilt University, Nashville, TN  jay.jerome@vumc.org】

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