霍夫曼調製相襯(Hoffman Modulation Contrast，簡稱HMC)是ROBERT HOFFMAN教授於(yu) 1975年提出的一種觀察方式①，是基於(yu) 斜照明技術加入偏振鏡、狹縫光闌和調製器改進而來的一種透明樣品觀察技術，特點是有三維立體(ti) 感，且適用於(yu) 塑料培養(yang) 皿，有人稱之為(wei) “窮人的DIC”，主要用於(yu) IVF注射等顯微操作。

MF53-HMC拍攝的卵母細胞

一、成像原理

斜照明成像與(yu) 明場成像對比②

斜照明（Oblique Illumination）技術又稱離軸照明（Off-Axis Illumination），是一種非常古老的技術，1866年由德國物理學家August Toepler提出③，並由阿貝聚光鏡的發明者Ernst Abbe完善，基本思路是利用偏軸光照射樣品，然後經過透明樣品發生衍射、反射和折射，最終除了未衍射的0級光，還能把一兩(liang) 個(ge) 臨(lin) 近級別的衍射光（1級和-1級）用到成像中，從(cong) 而提升分辨率和焦深，形成浮雕樣式的立體(ti) 成像，因此這種觀察方式又稱浮雕相襯（Relief Contrast，簡稱RC）。

標準PH相襯和CK40的RPC斜照明相襯，注意斜照明下整個(ge) 畫麵明暗漸變

斜照明提升分辨率和焦深的原理

斜照明很多地方跟簡易透射暗場相近，隻是它的光闌不是環形的，而是半圓或其他狹縫形狀，有更強方向性。題外話一句，極紫外光刻EUV也使用了斜照明技術。

霍夫曼光路結構

霍夫曼調製相襯在斜照明基礎上加入了三個(ge) 部件，偏振鏡，狹縫聚光鏡和物鏡調製器，使部分衍射光的強度大於(yu) 背景光，部分衍射光的強度小於(yu) 背景光，這樣就形成更高對比度的立體(ti) 成像。

當前霍夫曼調製相襯的專(zhuan) 利已經過了保護期，四大品牌都推出了自己的HMC技術，奧林巴斯Evident叫浮雕相襯RC（Relief Contrast，繼承以前RPC的命名），尼康叫高級調製相襯NAMC（Nikon Advanced Modulation Contrast），蔡司叫改進型調製相襯iHMC（Improved Hoffman Modulation Contrast），徠卡叫整合調製相襯IMC（Integrated Modulation Contrast），除了徠卡的是特有的機身調製器取代物鏡調製器，其他跟原始設計差距不大。

二、關(guan) 鍵部件

典型霍夫曼相襯需要三個(ge) 部件，偏振鏡，霍夫曼聚光鏡（帶狹縫光闌），霍夫曼物鏡（帶物鏡調製器）。

MF53-HMC的霍夫曼相襯配件

·光源偏振鏡

光源偏振鏡在光源和聚光鏡之間

偏振鏡在光源和聚光鏡之間，相當於(yu) 一個(ge) 起偏器，它可以旋轉，旋轉後可以調整成像的立體(ti) 感和對比度。

·霍夫曼聚光鏡

霍夫曼聚光鏡，注意半透明的狹縫檢偏器

霍夫曼聚光鏡又稱狹縫聚光鏡，一般采用轉盤式設計，按照10X/20X/40X三個(ge) 倍數有不同的狹縫光闌裝在聚光鏡前焦麵，另有留空孔用於(yu) 明場觀察。

聚光鏡狹縫光闌分為(wei) 三個(ge) 部分：占大部分的暗區，不透光；離軸的狹縫，100%透光；狹縫檢偏器，連著狹縫，尺寸跟狹縫相近，旋轉光源偏振鏡會(hui) 改變這個(ge) 區域的通光率，可以改變成像立體(ti) 感和對比度。

注意：由於(yu) 樣品在起偏檢偏的光路之後，而不是在起偏檢偏之間，因此霍夫曼可以看塑料培養(yang) 皿和塑料樣品。

簡化版的霍夫曼沒有偏振鏡，狹縫光闌隻有暗區和狹縫，沒有狹縫檢偏器。

·霍夫曼物鏡

霍夫曼物鏡會(hui) 有HMC、PMC、NAMC等標記

霍夫曼物鏡跟相襯物鏡相似，在物鏡後端的後焦平麵上嵌入了精密的物鏡調製器，這個(ge) 調製器不能移動不能取出。

霍夫曼物鏡後端可見三個(ge) 區域

物鏡調製器分成三個(ge) 區域：在邊緣的暗區，透射1%光線；狹窄的灰區，透射10-15%光線；透明區，連著灰區，100%透光。

霍夫曼物鏡能用於(yu) 明場、暗場和熒光觀察，但用在熒光觀察時效果不佳，因為(wei) 有調製器，其透光率低於(yu) 普通明場物鏡。

注意：霍夫曼的狹縫光闌和物鏡調製器有很強的方向匹配關(guan) 係，物鏡擰緊後，需要調整聚光鏡狹縫方向來匹配，非專(zhuan) 業(ye) 人士請不要調霍夫曼物鏡或聚光鏡，否則很難調節回最佳狀態。

IMC可調的狹縫插板，統一的物鏡調製器（IMC/BF文字和孔位相對而非相鄰）

另外整合調製相襯IMC的物鏡調製器設置在了物鏡後焦麵的共軛麵上，也就是在機身內(nei) 置而非物鏡內(nei) 置，因此可以使用霍夫曼物鏡以外的物鏡。但必須提醒的是，IMC是組合消色差設計，物鏡與(yu) 觀察頭是成套搭配實現消色差的，隨便換物鏡可能破壞消色差設計導致效果不佳。

三、成像特點

霍夫曼調製相襯成像接近DIC微分幹涉，並且在使用層麵上還有成本更低、工作空間大、可以觀察塑料培養(yang) 皿等優(you) 勢，因此廣泛應用於(yu) 顯微操作、IVF輔助生殖等領域。

霍夫曼可觀察塑料等各向同性材料，DIC不能④

1、強立體(ti) 感

霍夫曼可以提高透明樣品的可見性和對比度，圖像有強立體(ti) 感，效果接近DIC，有利於(yu) 顯微操作。

霍夫曼拍攝的口腔上皮細胞

2、豐(feng) 富細節，無光暈

霍夫曼沒有澤尼克相襯的光暈瑕疵，成像邊緣更清晰，且焦深更大，細節豐(feng) 富。

樣品形狀和方向不同影響了霍夫曼成像畫質

3、強方向性，低可重複性

這是個(ge) 缺點，霍夫曼觀察的效果與(yu) 狹縫方向、樣品方向相關(guan) 。舉(ju) 例而言，兩(liang) 台霍夫曼，物鏡擰緊之後的旋轉角度可能不一致，對應聚光鏡狹縫的角度也會(hui) 不一致，即便樣品在兩(liang) 台之間平移，得出的成像也會(hui) 有不同，相同原理，同一台霍夫曼，樣品旋轉角度不同，即便相同區域成像也會(hui) 不同。這導致霍夫曼等所有基於(yu) 斜照明的係統都存在可重複性問題，因此論文普遍傾(qing) 向用更高可重複性的相襯和DIC等觀察方式。

四、主要應用

霍夫曼顯微注射

1、IVF輔助生育

霍夫曼的強立體(ti) 感和大工作空間，讓它非常適合精密的顯微操作使用，比如在IVF輔助生育領域，霍夫曼可以為(wei) 卵胞質內(nei) 單精子注射（ICSI）技術提供成像支持。

2、轉基因研究

類似IVF中的精子注射，在各種轉基因研究中也有類似的原核注射（pronucleus injection）技術，使用霍夫曼可以為(wei) 顯微操作提供精確的立體(ti) 成像支持。

五、明美產(chan) 品推薦

1、顯微操作成像平台：MF53-HMC/MIX60-HMC

• 成像具有類似DIC的強立體(ti) 感，適合卵母等透明樣品

• 成本比DIC更有優(you) 勢，適合IVF等規模化使用

• 帶偏光鏡，可調節成像立體(ti) 感和對比度

• 可以滿足較厚透明樣品觀察

①HOFFMAN, R., GROSS, L. The modulation contrast microscope. Nature 254, 586–588 (1975). https://doi.org/10.1038/254586a0

②Pelc, Radek & Hostounský, Zdeněk & Otaki, Tatsuro & Katoh, Kaoru. (2020). Conventional, Apodized, and Relief Phase-Contrast Microscopy. 10.1007/978-1-0716-0428-1_10. 

③To¨pler A (1866) Ueber die Methode derSchlierenbeobachtung als mikroskopischesHu¨lfsmittel, nebst Bemerkungen zur Theorieder schiefen Beleuchtung. (Poggendorff ’s)Annalen der Physik und Chemie (Leipzig)127(4):556–580. https://doi.org/10.1002/andp.18662030405 [Annalen der Physik (Ber-lin) 203(4):556–580]

④Hoffman, R. (1989). Modulation Contrast and Differential Interference Contrast Techniques. In: Hemsley, D.A. (eds) Applied Polymer Light Microscopy. Springer, Dordrecht. https://doi.org/10.1007/978-94-011-7474-9_5

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